研究人员通过优化的pegRNA设计提高了植物的原始编辑效率

精确的基因组编辑可对活细胞中的DNA进行精确修饰,从而为植物育种提供了广泛的机会。由David R. Liu教授和他的同事开发的主要编辑器允许在所需的目标站点中安装所需的编辑。它们由工程改造的Cas9切口酶(H840A)-逆转录酶(RT)融合蛋白和主要的编辑指南RNA(pegRNA)组成。

科学院遗传与发育生物学研究所(IGDB)的高才霞教授和其他学者一起,将主要编辑器开发和优化为一种极其通用的编辑策略,以在水稻和小麦中产生可编程的点突变,插入和缺失,以及她的研究团队和合作者。

他们发现,植物主要编辑器的编辑效率受到PBS和RT模板序列的强烈影响,表明需要优化的pegRNA设计以产生更高的产物转化率。

为了确定有效的引物编辑的原则,IGDB的高教授和李嘉阳教授及其研究团队还报告了优化的pegRNA设计策略,这些策略可以最大程度地提高植物的引物编辑效率。

由于引物结合位点(PBS)与非靶链ssDNA的杂交是逆转录的第一步,因此研究人员假设PBS序列的解链温度(Tm)(以下称为PBS Tm)为对于主要编辑者来说很重要的参数。通过分析水稻原生质体中18个内源目标位点的主要编辑效率,他们发现PBS Tm强烈影响编辑效率,当水稻中PBS Tm为30°C时最大的主要编辑发生。

除了确定最佳的pegRNA设计之外,他们还介绍了通过使用双pegRNA进行主要编辑的进展。此策略依赖于两个pegRNA,它们产生各自的ssDNA襟翼,这些襟翼以反式彼此碱基对,同时在新合成的DNA的两条链上编码相同的编辑。

与单独使用单个pegRNA相比,这种新的编辑方法使主要编辑效率平均提高了3.0倍。此外,科学家们产生了由SpG(具有扩展的PAM靶向范围的工程Cas9)组成的主要编辑器,以扩展这种双重PegRNA编辑策略的靶向范围。在一起,优化PBS Tm并使用双重PegRNA策略可将水稻的主要编辑效率提高到17.4倍。

基于这两项进步,团队开发了一个用户友好的Web应用程序PlantPegDesigner,以帮助其他研究人员设计最适合其应用程序的主要编辑工具。

PlantPegDesigner为用户提供了灵活性,并可以根据他们的个人需求控制各种参数。该工具推荐间隔物-PAM序列,PBS序列,RT模板序列,以及用于构建载体的PCR克隆引物。与其他Web应用程序相比,PlantPegDesigner推荐的双pegRNA在水稻中的编辑活性提高了46倍。

总而言之,这项工作简化了pegRNA的设计,从而为在植物中进行有效的引物编辑提供了可靠的解决方案。优化的植物原始编辑系统的灵活性将促进植物育种和功能基因组学研究。

这项名为“在植物中使用优化的配对pegRNA进行高效引物编辑”的研究于3月25日在线发表在《自然生物技术》上。

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